對(duì)骨修復(fù)材料進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究時(shí)，連帶植入物進(jìn)行病理組織切片，可以更好地研究植入的骨修復(fù)材料的修復(fù)效果，更利于觀察修復(fù)材料與骨組織界面的結(jié)合情況。植入的骨修復(fù)材料及骨組織的質(zhì)地都很堅(jiān)硬，如果使用常規(guī)石蠟包埋組織切片，需要先剔除植入物，再對(duì)骨組織進(jìn)行脫鈣處理。人為剔除植入物，可能使原有的組織結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生改變，對(duì)評(píng)價(jià)植入物與周邊組織的結(jié)合情況造成一定的影響，最終影響后期的評(píng)價(jià)分析；脫鈣處理會(huì)使組織細(xì)胞皺縮，同時(shí)會(huì)破壞骨的礦化結(jié)構(gòu)。相較于以上技術(shù)，硬組織切磨技術(shù)具有多種優(yōu)勢(shì)：無(wú)需剔除植入物及進(jìn)行脫鈣處理，植入物-組織界面不會(huì)被破壞，保持了組織與植入物之間原有的組織結(jié)構(gòu)形態(tài)，且完整地保存了骨組織的礦化結(jié)構(gòu)，經(jīng)染色處理后，可用于骨修復(fù)材料植入后的骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)及骨整合相關(guān)的研究。本研究主要介紹含植入物不脫鈣骨組織病理切片技術(shù)在骨修復(fù)材料動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中的應(yīng)用情況，以期為骨組織相關(guān)的基礎(chǔ)研究提供參考。
硬組織切磨技術(shù)主要是針對(duì)人工種植牙、骨和含植入物的骨組織、埋置有堅(jiān)硬植入物的其他組織標(biāo)本，或在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段進(jìn)行了親骨熒光素標(biāo)記的不能進(jìn)行脫鈣的骨組織，通過(guò)脫水、浸潤(rùn)、包埋處理，由硬組織切磨系統(tǒng)完成的組織病理切片制作技術(shù)。利用硬組織切磨技術(shù)制備的不脫鈣骨組織病理切片，常被用于骨修復(fù)材料植入后的骨整合研究及骨形態(tài)計(jì)量分析中。
骨組織結(jié)構(gòu)學(xué)研究主要借助病理染色技術(shù)進(jìn)行，采用硬組織切磨技術(shù)制片的骨組織病理切片常用的組織顯色方法有蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE 染色）法、亞甲基藍(lán)-酸性品紅染色法、Goldner's 三色染色法、甲苯胺藍(lán)染色法、Van Gieson 苦味酸-品紅染色法和茜素紅染色法。硬組織切磨技術(shù)是開(kāi)展組織細(xì)胞染色技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)及研究骨修復(fù)、骨代謝情況不可替代的研究方法。
2.1 HE染色法在硬組織病理切片中的應(yīng)用
HE染色法（圖1）在骨組織中主要用于觀察植入界面周圍炎性細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)情況、周邊軟組織的修復(fù)能力、植入物與骨組織的骨結(jié)合率、可降解及可吸收植入物的組織反應(yīng)過(guò)程及最終的結(jié)局。嚴(yán)烏毛等[1]在延期負(fù)重加載條件下納米氟磷灰石/聚醚醚酮（nano-fluorapatite polyetheretherketone，nFA/PEEK）新型種植材料骨結(jié)合效能的研究中，將植入物植入比格犬下頜骨前磨牙區(qū)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將含植入物的骨組織經(jīng)光固化聚合樹(shù)脂包埋后，采用硬組織切磨技術(shù)制作不脫鈣骨組織病理切片，經(jīng)HE 染色，進(jìn)行了骨結(jié)合率的測(cè)定，即在鏡下測(cè)量種植材料與骨組織接觸的長(zhǎng)度及植入物骨內(nèi)界面的長(zhǎng)度，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)合其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定材料的良好生物相容性。韓雪等[2]在犬骨髓基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合納米晶羥基磷灰石/膠原/硫酸鈣（nano-hydroxyapatite/collagen/calcium sulfate hemihydrates，nHAC/CSH）裸鼠皮下成骨的實(shí)驗(yàn)研究中，將構(gòu)建的組織工程骨植入裸鼠皮下組織，4周后取材，制作不脫鈣骨組織病理切片，在鏡下可清楚看到 HE染色的復(fù)合體中的骨小梁、成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞，證明該復(fù)合體可促進(jìn)骨組織的形成。HE染色法作為病理學(xué)中的基礎(chǔ)染色方法，能夠較好地評(píng)價(jià)種植材料的生物相容性和安全性，尤其是在含植入物的骨組織中，不脫鈣的切磨處理方式能夠最大限度地還原材料與組織的接觸和組織反應(yīng)情況。但是，HE染色法無(wú)法較全面地評(píng)價(jià)含植入物的骨組織中纖維、軟骨及新骨的形成情況，所以，對(duì)含植入物的骨組織，常結(jié)合其他特殊染色法進(jìn)行分析。
圖1 羊脊椎骨植入（HE染色）
2.2 亞甲基藍(lán)-酸性品紅染色法在含植入物不脫鈣骨組織病理切片中的應(yīng)用
亞甲基藍(lán)-酸性性品紅染色法（圖2）可以比較清楚地顯示骨組織中的成骨細(xì)胞、類骨質(zhì)及新生骨組織，組織顏色對(duì)比明顯，較適用于測(cè)量植入物與骨結(jié)合的面積及研究骨缺損后成骨及軟組織的情況[3]。陳卿等[4]在早期負(fù)重載荷下 nFA/PEEK 成骨性能的研究中，將植入物植入比格犬下頜骨前磨牙區(qū)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取帶植入物的骨組織標(biāo)本，經(jīng)乙醇脫水、Technovit7200 VLC 浸潤(rùn)包埋后，采用硬組織切磨技術(shù)制備不脫鈣骨組織病理切片，經(jīng)亞甲基藍(lán) - 酸性品紅染色，研究植入物骨結(jié)合形態(tài)學(xué)，染色結(jié)果顯示，原礦化骨小梁較粗大、色淺，新生骨小梁較細(xì)長(zhǎng)、顏色較鮮艷呈深紅色、成骨細(xì)胞核呈深藍(lán)色、細(xì)胞基質(zhì)呈淡藍(lán)色、類骨質(zhì)呈紫灰色。于惠等[5]在不同植入扭矩的牙種植體 - 骨結(jié)合界面的組織學(xué)研究中，將BLBⅢ牙種植體植入比格犬的下頜骨，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取帶植入體的骨組織標(biāo)本行不脫鈣硬組織切磨技術(shù)進(jìn)行制片，在鏡下，經(jīng)亞甲基藍(lán)-酸性品紅染色的含植入物的骨組織中可見(jiàn)明顯的骨基質(zhì)、破骨細(xì)胞及新骨形成，且顏色區(qū)分亦較明顯。朱曉茹等[6]在采用動(dòng)物模型觀察高正加速度環(huán)境對(duì)口腔種植術(shù)后種植體-骨結(jié)合的影響研究中，將種植體植入新西蘭白兔下頜切牙部位，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取種植體及周圍骨組織標(biāo)本，制備不脫鈣骨組織病理切片，通過(guò)亞甲基藍(lán)-酸性品紅染色對(duì)種植體-骨結(jié)合率進(jìn)行了研究，可見(jiàn)亞甲基藍(lán)-酸性品紅染色對(duì)于含植入物的骨組織中的成骨細(xì)胞、骨基質(zhì)等的染色效果比HE染色更加直觀，組織顏色對(duì)比更加明顯，對(duì)評(píng)價(jià)骨缺損界面骨的生長(zhǎng)、植入物與骨組織的組織反應(yīng)具有重要的意義，更適用于觀察骨結(jié)合情況。
圖2 兔股骨髁植入（亞甲基藍(lán)-酸性品紅染色）
2.3 Goldner's 三色染色法在含植入物不脫鈣骨組織病理切片中的應(yīng)用
Goldner's 三色染色法（圖3）較適用于骨缺損修復(fù)后新骨形成的過(guò)程觀察，在Goldner's三色染色中，礦化骨被染成綠色，類骨質(zhì)被染成橙色或橙紅色，而軟骨被染成紫色或藍(lán)色。韓雪等[7]在經(jīng)微弧氧化堿熱處理后修復(fù)種植體周圍骨缺損的愈合情況的研究中，采用犬下頜前磨牙區(qū)制備骨缺損，修復(fù)種植體植入缺損區(qū)，制備不脫鈣骨組織病理切片，經(jīng)Goldner's三色染色，觀察了種植體周圍骨缺損區(qū)的修復(fù)情況。楊力碩等[8] 在自體牙骨粉與異種牛骨粉修復(fù)牙槽骨缺損的對(duì)比研究中，選取家兔上頜中切牙牙槽窩為植入部位，制備不脫鈣骨組織病理切片，采用Goldner's三色染色法，觀察了骨組織及類骨質(zhì)的形成情況，在該實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)不同周期骨粉修復(fù)骨組織的Goldner's 三色染色對(duì)比，可明顯觀察到組織切磨面的新生骨組織的形成情況，在4周時(shí)，被染成藍(lán)色的新生骨面積大，而在8周和12周的切片中，被染成藍(lán)色的新生骨面積逐漸減小，被深染的成骨細(xì)胞代替，然后與對(duì)照組進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)其新骨的形成速率。Goldner's三色染色法是基于染料分子大小對(duì)結(jié)構(gòu)致密、滲透性低或結(jié)構(gòu)疏松、滲透性高的骨組織穿透效果不同進(jìn)行染色的方法。因Goldner's三色染色法具有獨(dú)特的染色優(yōu)勢(shì)，所以被作為含植入物的骨組織的修復(fù)中比較常用的評(píng)價(jià)方法。但是，Goldner's三色染色法中，新骨的顏色與Bio-oss骨粉的成骨材料顏色相近，所以，如果植入物是Bio-oss骨粉，則在觀察骨修復(fù)時(shí)應(yīng)慎重選擇此方法。
圖3 羊脊椎骨植入（Goldner's三色染色）
2.4 甲苯胺藍(lán)染色法在含植入物不脫鈣骨組織病理切片中的應(yīng)用
軟骨中含硫酸軟骨素，而甲苯胺藍(lán)屬于嗜堿性染料，軟骨細(xì)胞及其基質(zhì)、成骨細(xì)胞等細(xì)胞成分會(huì)被染成藍(lán)紫色，所以甲苯胺藍(lán)染色法（圖4）適用于骨缺損修復(fù)后新、舊骨的對(duì)比觀察及對(duì)新骨數(shù)量的研究。鐘建鑫等[9]在評(píng)價(jià)多孔鉭顆粒對(duì)下頜骨骨缺損的修復(fù)效果的研究中，于比格犬下頜骨缺牙區(qū)構(gòu)建頜骨骨缺損模型，將多孔鉭顆粒及Bio-oss骨粉分別植入骨缺損區(qū)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，制備不脫鈣骨組織病理切片，經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后，對(duì)骨修復(fù)材料與骨組織結(jié)合情況及周邊骨組織成熟程度進(jìn)行了研究。薛喆等[10]在經(jīng)典孔隙結(jié)構(gòu)鈦合金內(nèi)置物在兔肱骨近端大結(jié)節(jié)處骨長(zhǎng)入的初步組織學(xué)研究中，將鈦合金螺釘植入制備的骨缺損模型區(qū)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取含植入物的骨組織標(biāo)本，使用Technovit7200 VLC光固化樹(shù)脂浸潤(rùn)、包埋后，利用EXAKT硬組織切磨系統(tǒng)制備不脫鈣骨組織病理切片，經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色，觀察隨著時(shí)間的演變內(nèi)置物中骨長(zhǎng)入的情況。靳夏瑩等[11]在評(píng)價(jià)富血小板纖維蛋白單獨(dú)用于上頜竇提升種植骨再生效果的研究中，在制備富血小板纖維蛋白后，以犬上頜第一磨牙區(qū)為研究部位，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后骨組織標(biāo)本經(jīng)樹(shù)脂包埋后制備不脫鈣骨組織病理切片，經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察了新骨形成情況。甲苯胺藍(lán)染色法是含植入物骨組織中非常常用的形態(tài)學(xué)及病理學(xué)研究方法，不僅可以觀察新生組織的鈣鹽沉積情況，統(tǒng)計(jì)成骨細(xì)胞數(shù)量，還常用于觀察骨缺損和樣品與組織之間的一些病理改變[12]，如能夠在鏡下看到壞死鈣化的軟骨組織及膠原纖維增生等，從而評(píng)價(jià)植入物周圍骨再生的效果及生物相容性。
圖4 兔股骨植入（甲苯胺藍(lán)染色）
2.5 Van Gieson苦味酸-品紅染色法在含植入物不脫鈣骨組織病理切片中的應(yīng)用
Van Gieson苦味酸-品紅染色原理與染料分子大小和組織滲透有關(guān)，可將骨組織染成紅色，將膠原纖維、肌纖維等染成黃色（圖5），在骨植入實(shí)驗(yàn)中用來(lái)觀察類骨質(zhì)的形成及植入體與周圍骨組織的整合程度等。王勇平等[13]在探討塑料包埋技術(shù)結(jié)合四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記制作不脫鈣骨組織切片的實(shí)驗(yàn)研究中，選取兔股骨為研究部位，進(jìn)行塑料包埋，制備不脫鈣骨組織切片，經(jīng)Van Gieson 苦味酸-品紅染色后顯示紅色區(qū)域?yàn)槌墒旃墙M織，黃色區(qū)域?yàn)槲吹V化的類骨質(zhì)。胡騰龍等[14]在顯微CT設(shè)定不同閾值范圍對(duì)評(píng)價(jià)生物活性玻璃在體內(nèi)成骨結(jié)果的影響研究中，采用新西蘭大白兔股骨髁缺損模型，植入生物活性玻璃，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，組織標(biāo)本制作為不脫鈣骨組織病理切片，經(jīng)Van Gieson 苦味酸-品紅染色，最后使用IPP軟件分析紅色部分即新生骨組織在總面積中的占比，然后進(jìn)行相關(guān)性分析，探究植入物的成骨性能差異。Van Gieson 苦味酸-品紅染色由于在染色時(shí)需臨時(shí)配制，放置一段時(shí)間后酸性品紅不易著色，且切片較易褪色（應(yīng)在染色后盡快保存及分析圖像），所以在實(shí)際應(yīng)用中較其他特殊染色法使用頻率略少。
圖 5 兔股骨植入（Van Gieson 染色）
2.6 ?茜素紅染色法在含植入物不脫鈣骨組織病理切片中的應(yīng)用
茜素紅屬于陰離子染料，可與諸多（鈣、鈦、鋁、鋯等）陽(yáng)性金屬離子發(fā)生顯色反應(yīng)，形成“鈣結(jié)節(jié)”。在骨組織中茜素紅與鈣離子形成紅色或者橘紅色的螯合物，并且顏色越深，表示該部位的骨組織鈣鹽沉積越多，所以常被用來(lái)染礦化的骨組織[15]。通過(guò)含植入物骨組織的茜素紅染色（圖6），能夠較形象地描述不同周期不同部位的含植入物骨組織中鈣鹽的沉積情況。Wise和Winkelmann[16]利用Micro-CT和茜素紅染色相結(jié)合評(píng)估了羥基脲對(duì)荷蘭兔胎兒骨骼的影響，結(jié)果顯示，Micro-CT和茜素紅染色都能夠很清晰地觀察到羥基脲對(duì)于胎兒骨骼的畸變效果，但是，Micro-CT對(duì)于鈣化程度不是很高的骨組織（邊緣位置或者新的骨組織即將形成及缺損）成像結(jié)果不明顯，而結(jié)合茜素紅染色則能夠觀察到骨組織中一些輕微的鈣化情況。
圖6 兔股骨植入（茜素紅染色）
2.7 親骨熒光素標(biāo)記在含植入物不脫鈣骨組織病理切片中的應(yīng)用
親骨熒光素是指能夠與骨組織中鈣離子特異性結(jié)合的熒光染料，比較常用的有四環(huán)素、茜素絡(luò)合酮、鈣黃綠素（圖7）等，注入體內(nèi)后，可以與骨組織尤其是新生的骨組織相結(jié)合，經(jīng)不脫鈣硬組織切磨技術(shù)制備組織切片后，由特定波長(zhǎng)激發(fā)，可在熒光顯微鏡下將示蹤的骨組織呈現(xiàn)出來(lái)[17]。
宋亞平等[18]在三種復(fù)合型骨移植材料早期修復(fù)骨缺損的比較研究中，于比格犬脛骨干骺端制備骨缺損，將骨修復(fù)材料植入缺損區(qū)域，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，皮下分別注射鹽酸四環(huán)素、鈣黃綠素、茜素紅進(jìn)行體內(nèi)熒光標(biāo)記，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將骨組織標(biāo)本制備成不脫鈣骨組織病理切片，用于測(cè)量熒光標(biāo)記率，對(duì)新生骨形成量進(jìn)行了研究。周宏志等[19]在熒光標(biāo)記法對(duì)“腦回形”微弧氧化表面植入物早期骨結(jié)合的評(píng)價(jià)研究中，于兔股骨髁部植入植入體，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中皮下注射鈣黃綠素，進(jìn)行體內(nèi)茜素紅-鈣黃綠素雙色熒光標(biāo)記，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取骨組織標(biāo)本制備不脫鈣骨組織病理切片，對(duì)骨組織礦化速率進(jìn)行了研究。
圖7 股骨髁植入（茜素紅和鈣黃綠素標(biāo)記）
2.8 免疫組化在含植入物不脫鈣骨組織病理切片中的應(yīng)用
通常情況下，在免疫組化染色中，骨組織幾乎都需要進(jìn)行脫鈣處理，而對(duì)于不脫鈣骨的免疫組化染色，因制片難度高，制片方式不同于軟組織或者脫鈣后的骨組織，并且骨組織中含大量鈣鹽，所以對(duì)含植入物不脫鈣骨組織的免疫組化染色研究相對(duì)較少。然而李劍等[20] 利用改進(jìn)的低溫甲基丙烯酸甲 酯（methyl methacrylate，MMA） 包埋SD大鼠脛骨，制備不脫鈣骨切片，最后進(jìn)行免疫組化和原位雜交，順利觀察到了切片中的陽(yáng)性表達(dá)，讓含植入物的硬組織切片的免疫組化染色成為可能。Knabe 等[21]在評(píng)價(jià)植入物的成骨性能中，利用乙醇固定取代甲醛，并用聚甲基丙烯酸甲酯和聚甲基丙烯酸丁酯混合包埋，最后進(jìn)行不脫鈣的切片，經(jīng)免疫組化染色，成功檢測(cè)到了陽(yáng)性信號(hào)。Yang等[22]在2019年與密歇根大學(xué)牙科學(xué)院生物與材料科學(xué)系聯(lián)合發(fā)布的一篇文章中，利用4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）固定，8%明膠包埋來(lái)處理未脫鈣的小鼠顱面組織，然后進(jìn)行SOX9免疫染色、OSX和E11/Podoplanin 雙重免疫染色，均能夠在細(xì)胞中檢測(cè)到陽(yáng)性表達(dá)。Fujihara 等[23]在利用未脫鈣骨組織的冷凍切片來(lái)探究異位礦化的骨組織形態(tài)學(xué)中，同樣使用免疫組化對(duì)ENPP1突變小鼠進(jìn)行定量評(píng)估，其樣本用0.3% 過(guò)氧化氫處理，在用馬血清封閉后，用3,3'-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽和過(guò)氧化氫顯色，最后獲得了具有陽(yáng)性反應(yīng)的切片。在硬組織的制片過(guò)程中，包埋經(jīng)常要求溫度為45~55℃，且時(shí)間較長(zhǎng)，容易導(dǎo)致抗原性喪失，而通過(guò)低溫包埋或冷凍骨組織切片技術(shù)及聚甲基丙烯酸甲酯包埋甚至明膠包埋、過(guò)氧化苯甲酰等的聚合，能夠較好地維持骨組織的抗原活性，不脫鈣骨組織即能夠進(jìn)行免疫組化染色，對(duì)植入材料及骨組織進(jìn)行定位或定量研究具有重要的意義。但是，不脫鈣骨組織的免疫組化亦有明顯的缺點(diǎn)，如硬組織切片一般較厚，有時(shí)抗體無(wú)法滲透進(jìn)下層組織，可能會(huì)導(dǎo)致染色不均或假陰性，鈣鹽的沉積也可能造成沖洗困難等，以上情況會(huì)導(dǎo)致整個(gè)免疫組化的染色時(shí)間及抗體量較難控制。
骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)是在不脫鈣骨組織病理切片技術(shù)及活體熒光標(biāo)記技術(shù)的基礎(chǔ)上，在二維的不脫鈣骨組織病理切片圖像上利用體視學(xué)方法，推導(dǎo)出反映骨重建、骨結(jié)構(gòu)的三維參數(shù)，即動(dòng)態(tài)參數(shù)及靜態(tài)參數(shù)的研究方法，測(cè)定對(duì)象為不脫鈣的骨組織或是在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段進(jìn)行熒光標(biāo)記的骨組織標(biāo)本。
采用不脫鈣硬組織制片技術(shù)制備組織切片并進(jìn)行形態(tài)學(xué)定量分析，可同時(shí)測(cè)定骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的靜態(tài)參數(shù)和動(dòng)態(tài)參數(shù)。靜態(tài)參數(shù)用來(lái)描述骨量的多少和骨小梁的形態(tài)，可對(duì)描述骨小梁面積、厚度、分離度參數(shù)等信息進(jìn)行定量分析。在對(duì)動(dòng)物活體進(jìn)行熒光標(biāo)記后，可測(cè)量的動(dòng)態(tài)參數(shù)包括骨吸收參數(shù)和骨形成參數(shù)，通過(guò)以上參數(shù)可以了解骨表面礦化量和礦化速率。黎永奇等[24] 在觀察HU-308藥物緩釋涂層對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠植入物周骨密度、類骨質(zhì)形成和骨吸收的影響研究中，將帶植入物的大鼠脛骨制作成不脫鈣骨組織病理切片，經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色，對(duì)骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)（植入物螺紋內(nèi)骨密度、類骨質(zhì)周長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)和骨吸收周長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)）進(jìn)行了測(cè)定、分析。
通常情況下，對(duì)不脫鈣的骨組織及埋置有骨修復(fù)等植入物的骨組織進(jìn)行病理組織切片制作，可利用EXAKT硬組織切磨系統(tǒng)[25-26]。含植入物不脫鈣骨組織病理切片技術(shù)制備的病理組織切片，保持了材料與骨結(jié)合界面的完整性，是研究結(jié)合界面的重要方法，已被廣泛應(yīng)用于骨修復(fù)材料的各種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，包括大動(dòng)物非臨床的實(shí)驗(yàn)研究。但是，其亦存在不足，如整個(gè)制片過(guò)程較為復(fù)雜，制片操作步驟繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，且成本昂貴；材料與組織之間的硬度與密度并不完全一致，在硬組織脫水、浸透、包埋處理過(guò)程中造成材料與組織界面間隙變寬或變窄，容易引起界面結(jié)合假象；相較于軟組織切片，難以把握染色過(guò)程（蝕刻過(guò)程等），想要獲得理想的染色切片具有一定的難度。
不同染色方法的特點(diǎn)和側(cè)重點(diǎn)各不相同，能夠具體應(yīng)對(duì)不同的研究目的。對(duì)植入物與組織界面的研究，應(yīng)根據(jù)植入物及觀察的組織不同選擇染色方法，甚至結(jié)合脫鈣骨的軟組織切片染色，以期得到可靠的形態(tài)學(xué)、組織學(xué)評(píng)價(jià)依據(jù)。武登誠(chéng)和李盛林[27]在介紹口腔醫(yī)學(xué)中對(duì)硬組織切磨技術(shù)的應(yīng)用中，利用 HE和甲苯胺藍(lán)染色硬組織切片，并對(duì)比觀察了植入界面的骨性接觸與纖維走向；Yang等[22]用HE染色和免疫熒光染色對(duì)比分析了抗體在組織中的具體陽(yáng)性表達(dá)位點(diǎn)。HE染色主要是觀察植入物誘發(fā)的骨組織的組織反應(yīng)，側(cè)重評(píng)價(jià)其基本的生物相容性；亞甲基藍(lán)-酸性品紅染色主要觀察成骨細(xì)胞及新生骨等，側(cè)重評(píng)價(jià)骨生成、骨結(jié)合率及計(jì)算成骨面積；Goldner's三色染色主要觀察軟骨、類骨質(zhì)及礦化骨，側(cè)重骨組織修復(fù)，對(duì)于不同周期的礦化程度觀察對(duì)比明顯[28]；甲苯胺藍(lán)染色主要觀察新骨形成、骨細(xì)胞、骨基質(zhì)及一些病理改變，側(cè)重骨修復(fù)觀察，而且新生骨和成熟骨之間界限清晰；Van Gieson 苦味酸-品紅染色主要觀察骨組織和膠原纖維，側(cè)重植入物與組織的整合程度；茜素紅染色主要觀察骨組織鈣鹽沉積；親骨熒光素標(biāo)記主要用于示蹤，特別是對(duì)于新骨形成、骨代謝等進(jìn)行定量分析；而免疫組化主要確定骨組織中的抗原，從而進(jìn)行異位礦化定性、定量研究[3，29]。因每種染色方法均存在不足，所以在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)結(jié)合多種染色方法進(jìn)行觀察研究。
骨修復(fù)材料的骨整合研究主要是對(duì)生物學(xué)（組織學(xué)、細(xì)胞和分子生物學(xué)）方面、醫(yī)學(xué)影像學(xué)方面及生物力學(xué)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)分析[30]。對(duì)骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析研究的方法很多，基于影像學(xué)技術(shù)的骨組織結(jié)構(gòu)形態(tài)分析方法具有無(wú)創(chuàng)、對(duì)樣本損傷小的優(yōu)點(diǎn)，在對(duì)骨組織性質(zhì)的評(píng)價(jià)研究中優(yōu)先被選用[31]。賴春花等[32]對(duì)顯微CT與硬組織切片技術(shù)在評(píng)價(jià)牙種植體骨結(jié)合中應(yīng)用的對(duì)比研究中發(fā)現(xiàn)，顯微CT可以宏觀地觀察到種植體周圍骨質(zhì)的情況，但對(duì)種植體-骨界面成骨現(xiàn)象顯示不夠清晰，經(jīng)不脫鈣硬組織切片組織病理染色后其對(duì)種植體-骨界面的細(xì)微情況顯示較清晰。針對(duì)一些復(fù)雜的含植入物的骨組織，顯微CT能夠構(gòu)建出三維的形態(tài)，對(duì)組織進(jìn)行立體分析。Palmquist等[33]利用顯微CT及不脫鈣骨組織的甲苯胺藍(lán)染色，評(píng)估3D打印的多孔 Ti6Al4V植入的骨形成情況，發(fā)現(xiàn)通過(guò)甲苯胺藍(lán)染色的含植入物組織在定量組織形態(tài)計(jì)量學(xué)中與顯微CT的3D測(cè)量結(jié)果有高度的相關(guān)性；Liu等[34]在用形態(tài)計(jì)量學(xué)評(píng)價(jià)顯微CT能否作為松質(zhì)骨的3D評(píng)估分析方法時(shí)對(duì)比了HE染色結(jié)果，利用SPSS 16.0.1軟件分析，發(fā)現(xiàn)顯微CT與組織切片在骨體積密度、骨表面密度和小梁厚度等方面具有顯著的相關(guān)性。因此，在對(duì)含植入物的骨形成研究中經(jīng)常使用組織形態(tài)學(xué)和顯微CT結(jié)合的方法來(lái)進(jìn)行分析，確保結(jié)果更加可靠、立體。
盡管存在難點(diǎn)，但含植入物不脫鈣骨組織病理切片技術(shù)和組織染色方法已成為評(píng)價(jià)骨整合的重要研究手段和不可或缺的一部分。
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