文章出處：
中國(guó)組織工程研究 第16卷 第35期 2012-08-26初版
齊進(jìn)，黃萍，張連方，豐盛梅，鄧廉夫
文章亮點(diǎn)：
①采用EXAKT切磨系統(tǒng)技術(shù)能制作出高質(zhì)量的軟、硬組織薄層切片。
②EXAKT 切磨系統(tǒng)可清晰顯示各種組織結(jié)構(gòu)和人工植入物。
文章概要:
實(shí)驗(yàn)對(duì)做形態(tài)計(jì)量觀察的骨標(biāo)本和含金屬植入物的軟硬組織標(biāo)本采用不脫鈣有機(jī)玻璃包埋技術(shù)進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)采用EXAKT硬組織切磨系統(tǒng)制作皮質(zhì)骨和含金屬植入物的軟硬組織切片，能獲得厚薄均一的5-10μm薄切片。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EXAKT硬組織切磨系統(tǒng)制作的薄切片在高倍鏡下更容易聚焦，可清晰顯示組織結(jié)構(gòu)及熒光標(biāo)記。
背景：
目前常用的Polycut 硬組織切片機(jī)難以制作皮質(zhì)骨或含堅(jiān)硬植入物組織的薄層切片，近年來(lái)這些切片多用EXAKT硬組織切磨系統(tǒng)進(jìn)行制作。
目的：
實(shí)驗(yàn)采用EXAKT切磨系統(tǒng)制作含金屬內(nèi)植物的軟、硬組織薄層切片。
方法：
取大鼠股骨遠(yuǎn)端、小鼠股骨干骨折部、帶有鈦金合金種植體的犬下頜骨和帶有鈷鉻支架的豬冠狀主動(dòng)脈標(biāo)本，經(jīng)多聚甲醛固定和丙酮脫水后用有機(jī)玻璃（甲基丙烯酸甲酯）浸透包埋。組織包埋塊用EXAKT系統(tǒng)作厚度約300μm的切片，然后磨片至5-10μm的切片。不同切片用蘇木精-伊紅和甲苯胺藍(lán)染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài)。
結(jié)果與結(jié)論：
甲苯胺藍(lán)染色顯示，大鼠股骨遠(yuǎn)端骨組織切片中干骺端礦化骨小梁呈淺藍(lán)色、皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)完整，無(wú)碎裂。含帶有鈦合金種植體的犬下頜骨切片淺藍(lán)色宿主骨與黑色金屬種植體密切結(jié)合，形成牢固的界面。四環(huán)素標(biāo)記的小鼠股骨干骨折部骨痂切片，在熒光顯微鏡（紫外光）下顯示明顯的雙層熒光帶。蘇木精-伊紅染色的包裹鈷鉻合金支架的豬冠狀動(dòng)脈組織切片顯示，支架材料維持原味，與血管壁無(wú)脫離或游離現(xiàn)象，組織無(wú)皺紋或折疊。結(jié)果提示，采用EXAKT切磨系統(tǒng)技術(shù)能制作出高質(zhì)量軟、硬組織薄層切片，可清晰顯示各種組織結(jié)構(gòu)和人工植入物。
關(guān)鍵詞：
EXAKT切磨系統(tǒng)；骨；植入物；有機(jī)玻璃；切片；骨組織構(gòu)建
引言
對(duì)含熒光素標(biāo)記的骨組織常用Polycut硬組織切片機(jī)進(jìn)行切片，優(yōu)點(diǎn)是能切5-10μm厚的切片，清晰顯示骨結(jié)構(gòu)和熒光標(biāo)記[1-3]，缺點(diǎn)是切堅(jiān)硬的皮質(zhì)骨易發(fā)生骨碎裂，導(dǎo)致切片質(zhì)量較差，并且不能切割金屬植入物。因此，切皮質(zhì)骨和含金屬植入物的骨標(biāo)本常用Leica菇切片機(jī)或慢速金剛環(huán)鋸[4-6]。這些器械切出的切片較厚，常超過(guò)100μm，需要用磨片機(jī)甚至手工進(jìn)行磨片[4-6]。這樣摸出的切片厚度不一，甚至產(chǎn)生同意切片不同部位的厚薄不勻，導(dǎo)致鏡下觀察時(shí)難以聚焦，影響照片質(zhì)量。對(duì)于這些常規(guī)設(shè)備難以制作的硬組織切片，目前多用德國(guó)EXAKT硬組織切磨系統(tǒng)進(jìn)行制備[7-9]，這些切片能達(dá)到＜20μm的厚度，并保持硬組織，組織與植入物之間的原有組織結(jié)構(gòu)形態(tài)。
實(shí)驗(yàn)室介紹采用EXAKT硬組織切磨系統(tǒng)制備皮質(zhì)骨及含內(nèi)植物軟硬組織薄切片的計(jì)提方法及可能達(dá)到的效果。
1、材料和方法
設(shè)計(jì)：組織學(xué)實(shí)驗(yàn)。
時(shí)間及地點(diǎn)：于2008/2011上海市傷骨科研究所實(shí)驗(yàn)室收集。包括：①3月齡雌性SD大鼠的股骨遠(yuǎn)端組織標(biāo)本。②含四環(huán)素雙標(biāo)記的3月齡小鼠股骨干骨折部骨痂組織標(biāo)本。③含鈦合金合金種植體的雄性犬下頜骨組織標(biāo)本。④含植入鈷鉻合金支架的雄性豬冠狀動(dòng)脈組織標(biāo)本。
主要試劑和儀器：
方法：組織固定、脫水和包埋：新鮮組織塊至于40g/L多聚甲醛固定液中固定48h后流水沖洗24h，在EXAKT 510脫水儀中用100%丙酮溶液脫水。脫水后將組織塊植入塑料模具，在EXAK T520光固化包埋機(jī)中做有機(jī)玻璃包埋。
組織切片：有機(jī)玻璃聚合后去除塑料模具，用Technovit 4000黏合劑將有機(jī)玻璃包埋樣本黏于載玻片A。將載玻片A真空吸附于EXAKT 300CP切片機(jī)夾具上，通過(guò)激光在包埋標(biāo)本上定位，用金剛鋸條切割暴露標(biāo)本表面。將載玻片A吸附于EXAKT 400CS磨片機(jī)對(duì)標(biāo)本表面進(jìn)行拋光。在EXAKT 401載片黏合裝置張用Technovit 7210VLC膠水將載玻片B合成一個(gè)類似于三明治的結(jié)構(gòu)。將三明治結(jié)構(gòu)的載玻片A側(cè)吸附于EXAKT 300CP切片機(jī)夾具上，從載玻片B側(cè)通過(guò)自動(dòng)步進(jìn)定位裝置切割厚度約300μm的切片。
把黏附切片的載玻片B吸附于待滾動(dòng)磨盤(pán)裝置和電子測(cè)量控制系統(tǒng)的EXAKT 400CS微磨片裝置，針對(duì)不同標(biāo)本預(yù)先設(shè)定磨片的厚度。在各級(jí)SiC&Al?O?砂紙上磨片至預(yù)定厚度，最后用細(xì)砂紙對(duì)切片表面進(jìn)行拋光。整個(gè)過(guò)程通過(guò)AW100測(cè)量控制系統(tǒng)進(jìn)行控制。實(shí)驗(yàn)的切片最終厚度為5-10μm。
切片染色方法：
蘇木精-伊紅染色：將蘇木精直接滴加于植入鈷鉻支架的豬冠狀動(dòng)脈切片組織表面，視標(biāo)本類型掌握染色時(shí)間，通常5-30min，流水清洗殘留染液后切片植入體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸乙醇30S，流水沖洗后再入溫水返藍(lán)，而后進(jìn)入伊紅復(fù)染1min，自然干燥后直接用BASO病理封固膠封固，光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)。
甲苯胺藍(lán)染色：將體積分?jǐn)?shù)1%甲苯胺藍(lán)染液直接滴加于大鼠股骨遠(yuǎn)端骨組織切片和含帶有鈦合金種植體的犬下頜骨切片表面5-30min(染色時(shí)間視標(biāo)本類型而定)，流水沖洗，待自然干燥后直接用BASO病理封固膠封固。不染色切片直接用BASO病理封固膠封固，光學(xué)顯微鏡下觀察各組組織形態(tài)。
采用免疫熒光染色觀察小鼠股骨骨折骨痂組織形態(tài)，熒光顯微鏡下觀察組織形態(tài)。
主要觀察指標(biāo)：各組染色標(biāo)本內(nèi)的顯微結(jié)構(gòu)，不同軟硬組織切片的顯示效果。
2、結(jié)果
2.1切片質(zhì)量控制結(jié)果 各種骨標(biāo)本及含內(nèi)植物的軟、硬組織標(biāo)本，經(jīng)有機(jī)玻璃包埋后，均可通過(guò)EXAKT切磨系統(tǒng)制作出5-10um厚的薄切片。由于磨片厚度經(jīng)螺旋測(cè)微器自行測(cè)量，因此切片各部位厚度均一(差別不超過(guò)+0.01微米)，且切片表面光整。光鏡下聚焦后各部位結(jié)果均能清晰顯示。
2.2不同軟硬組織切片的顯示效果 甲苯胺藍(lán)染色的大鼠股骨遠(yuǎn)端骨組織切片顯示，切片中干骺端礦化骨小梁呈淺藍(lán)色、而未礦化的骨小梁表面類骨質(zhì)及骺板軟骨基質(zhì)呈深藍(lán)色：淺藍(lán)色的皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)完整，無(wú)碎裂，見(jiàn)圖1。
四環(huán)素標(biāo)記的小鼠股骨骨痂切片(未作其他染色)顯示，在熒光顯微鏡(紫外光)下顯示明顯的雙層熒光帶，據(jù)此可測(cè)定新骨形成和骨改建，見(jiàn)圖2。
甲苯胺藍(lán)染色后的含螺紋狀金屬種植體的犬下頜骨切片顯示，金屬種植體保持在原位，淺藍(lán)色宿主骨與黑色金屬種植體密切結(jié)合，形成牢固的界面，見(jiàn)圖3。
蘇木精-伊紅染色的包裹鈷鉻合金支架材料的豬冠狀動(dòng)脈組織切片顯示，支架材料維持在原位，與血管壁無(wú)脫離或游移現(xiàn)象，組織無(wú)皺縮或折疊，見(jiàn)圖4。
3、討論骨是一種堅(jiān)硬的結(jié)締組織，如做石蠟切片，需先進(jìn)行脫鈣。雖然脫鈣骨切片常用于觀察骨的細(xì)胞變化[10]，但脫鈣過(guò)程可引起組織結(jié)構(gòu)皺縮，影響骨結(jié)構(gòu)的定量分析。更重要的是以四環(huán)素為代表的骨熒光標(biāo)記物與新骨內(nèi)鈣鹽鰲合[11-12]，脫鈣可使熒光標(biāo)記消失，影響對(duì)骨改建的動(dòng)態(tài)分析。因此，對(duì)做形態(tài)計(jì)量觀察的骨標(biāo)本采用不脫鈣有機(jī)玻璃包埋技術(shù)進(jìn)行處理[13-14]。有研究對(duì)含金屬植入物的骨標(biāo)本也采取不脫鈣技術(shù)進(jìn)行處理[15]，主要有2個(gè)原因:①脫鈣不能軟化金屬植入物。②脫鈣引起的骨組織皺縮可引起骨-植入物界面分離，不能反映愈合過(guò)程中植入物與骨的結(jié)合情況。
雖然不脫鈣的有機(jī)玻璃包埋能夠維持硬組織(骨、牙)和金屬植入物的形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性，但切片技術(shù)往往是保證觀察質(zhì)量的關(guān)鍵。最多用于硬組織切片的是德Polycut硬組織切片機(jī)，可切5-10μm的薄切片。除了實(shí)驗(yàn)研究外，該切片技術(shù)在臨床上廣泛用于髂骨活檢標(biāo)本[16-17]。
髂骨活檢結(jié)果既是診斷骨質(zhì)疏松和多種骨病的金標(biāo)準(zhǔn)，而且也是評(píng)判治療效果的重要指標(biāo)[18]。髂骨活檢前一段時(shí)間服用2次四環(huán)素進(jìn)行新骨雙重標(biāo)記，使新骨形成區(qū)有兩條熒光條帶[17-19]。骨結(jié)構(gòu)和靜態(tài)骨改建參數(shù)的測(cè)定在甲苯胺藍(lán)染色切片上進(jìn)行，而動(dòng)態(tài)骨改建參數(shù)依靠在未染色切片上測(cè)量四環(huán)素?zé)晒鈼l帶的長(zhǎng)度和兩條條帶的間距。熒光標(biāo)記在薄切片中的清晰度遠(yuǎn)優(yōu)于厚切片。
然而，Polycut切片機(jī)適用于髂骨這類含大量松質(zhì)骨和較疏松皮質(zhì)骨的部位[20]，不適合切致密皮質(zhì)骨，更不能切割堅(jiān)硬的金屬植入物。因此，許多研究采用慢速金剛環(huán)踞切割皮質(zhì)骨或含金屬植入物骨標(biāo)本[5-6]。但用環(huán)踞切出的切片往往大于100μm，經(jīng)磨片也只能達(dá)到50μm，而且磨片厚度不易掌握。這種厚片內(nèi)的結(jié)構(gòu)較難聚焦，尤其是骨內(nèi)熒光標(biāo)記，常會(huì)影響測(cè)試的精確性。目前越來(lái)越多學(xué)者用EXAKT硬組織切磨系統(tǒng)制作皮質(zhì)骨和含金屬植入物骨切片[7-9]。該系統(tǒng)對(duì)切、磨片厚度均可精確調(diào)控，最終片厚可達(dá)5-10μm，且厚度均一。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用EXAKT硬組織切磨系統(tǒng)制備的薄層骨切片在顯微鏡下容易聚焦，由于切片各部位厚度均勻，較少出現(xiàn)聚焦困難的現(xiàn)象。因此，即使在高倍鏡下也可顯示清晰的骨結(jié)構(gòu)和熒光標(biāo)記。此外由于骨結(jié)構(gòu)形態(tài)保持完好，該切片還適用于觀察金屬內(nèi)植物與骨的界面情況，這對(duì)研究骨內(nèi)植物的愈合具有重要意義。
對(duì)軟組織作顯微鏡觀察一般采用石蠟切片，但在植入鈷鉻合金支架的情況下石蠟切片不一定適用。原因是石蠟切片刀難以切動(dòng)較硬的合金支架，硬切容易造成支架變形或碎裂。此外，支架和動(dòng)脈組織硬度不一，在切片時(shí)容易造成2者分離。因此需要尋找一種新的方法來(lái)處理這種標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)對(duì)植入鈷鉻合金支架的豬冠狀動(dòng)脈采用硬組織切片方法進(jìn)行處理取得了良好的效果。鏡下顯示支架及動(dòng)脈結(jié)構(gòu)完好，兩者呈密切結(jié)合。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示對(duì)含有金屬材料的軟組織可用有機(jī)玻璃包埋方法。有機(jī)玻璃浸透可增加軟組織的硬度，在切片時(shí)不易發(fā)生變形。對(duì)這種有機(jī)玻璃組織包埋塊用 EXAKT硬組織切磨系統(tǒng)制作切片可獲得滿意的觀察效果。因此，實(shí)驗(yàn)為觀察含金屬支架的軟組織提供了一個(gè)有效的方法。
綜上所述，
EXAKT硬組織切磨系統(tǒng)適用于制作皮質(zhì)骨和含金屬內(nèi)植物組織的薄層切片，這種切片可做各種染色進(jìn)行定量組織形態(tài)觀察，可廣泛應(yīng)用于骨科、口腔、腫瘤、心血管及整形外科等研究領(lǐng)域。
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