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針對傳統(tǒng)樹脂包埋法缺點的改良報道較少，有科研團隊嘗試構(gòu)建識別程序以提高效率［17］。有文獻報道了一種預(yù)防軟組織樹脂切片發(fā)生脫片的方法［16］，也有通過改善載玻片的方式進行預(yù)防脫片的報道［18］。但國內(nèi)對不脫鈣樹脂包埋切片的報道仍以介紹性的報道為主［19-20］。目前國內(nèi)外尚沒有在樹脂液凝固、切片、染色過程中對樹脂包埋不脫鈣骨技術(shù)的改良方法的報道。為提高不脫鈣骨組織的樹脂包埋法的效率及穩(wěn)定性，我們對大量實驗經(jīng)驗進行了總結(jié)，嘗試對傳統(tǒng)的樹脂包埋切片法進行改良。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將復(fù)數(shù)脛骨樣本平行包埋于一個樹脂塊中有效可行，提高了樹脂塊的利用率。利用CO2沖入樹脂包埋液，可有效縮短樹脂凝固時間并提高樹脂凝固率。在切片過程中，使用未凝固樹脂制備液涂抹切面可顯著減少小塊硬質(zhì)骨組織脫片的發(fā)生，且不會影響對骨形成的分析。在染色分析前，發(fā)現(xiàn)加熱切片樣本可以降低脫片率，且不影響成骨細胞的分析。改良樹脂包埋多個小鼠不脫鈣骨組織的方法為樹脂包埋不脫鈣骨組織研究提供了有效的、高效的方法思路，可能是一種理想的骨組織學研究方法。具體報道如下。

1.1 實驗動物
13周齡雄性C57BL/6J 小鼠15 只（Jackson Laboratory），體質(zhì)量27.3±0.76 g。動物實驗經(jīng)美國特種外科醫(yī)院實驗動物使用與管理委員會以及美國康奈爾大學醫(yī)學部IACUC批準。
1.2 主要試劑
鈣黃綠素、壬基苯基-聚乙二醇乙酸酯（NPG）、過氧化苯甲酰（BPO）、丁二醇、甲苯胺藍O、固綠FCF、無水切片封固劑及1-乙酰氧基- 2-甲氧基乙烷（AME）（Sigma）。單體甲基丙烯酸甲酯（MMA）、N，N-二甲基-對甲苯胺（DMPT）（WAKO）。氧化鋁60、水性切片封固劑（Millipore），尿素（Fisher Scientific）。
1.3 小鼠骨組織熒光標記及骨組織準備
小鼠在12.3周齡時腹腔注射鈣黃綠素（2.5 mg/mL），按每克小鼠體質(zhì)量注射10 μL，3 d后同劑量注射第2次鈣黃綠素，再過2 d后以CO2窒息法處死小鼠［21］，取小鼠小腿置于10%福安馬林液中固定2 d。隨后用鑷子及組織剪清除附著于脛骨的肌肉、肌腱等軟組織，去除腓骨。將脛骨置于搖床上常溫乙醇梯度脫水（70%乙醇1 d→80%乙醇1 d→90%乙醇1 d→100%乙醇2 d），脫水完畢后立即進行樹脂液（表1）滲透3 d（第2天更換樹脂滲透液1次）。乙醇及滲透液液面應(yīng)高于包埋盒2 cm。
1.4 樹脂包埋液的配制以及凝固時間測試
將樹脂包埋液按照制備方法的不同分為沖入CO2（實驗組）、沖入空氣（對照組）兩組。實驗組：按照NPG7 mL，MMA工作液100 mL，BPO 550 mg比例加入錐形瓶并攪拌，攪拌過程中沖入CO2 15 min（圖1A）。然后加入DMPT 500 μL，繼續(xù)攪拌10 min后進行分裝。對照組：按照NPG 7 mL，MMA工作液100 mL，BPO 550 mg比例加入錐形瓶并攪拌，攪拌過程中以電子移液槍輔助沖入空氣15 min。然后加入DMPT 500 μL，繼續(xù)攪拌10 min后進行分裝。分別將兩組包埋液分裝入液體閃爍瓶（20 mL圓柱形玻璃瓶，用于組織包埋，下文中統(tǒng)稱為組織包埋瓶）中，10 mL/瓶，每組10瓶，記錄并比較兩組包埋液的凝固時間及凝固程度。
1.5 復(fù)數(shù)脛骨的包埋
按照上述沖入CO2組的配制方式制備包埋液。取內(nèi)徑4 mm的火石玻璃管，用乙醇燈燒結(jié)封閉玻璃管一端，管內(nèi)加入包埋液，然后依次將滲透完畢的脛骨置于玻璃管中，兩脛骨間隔約4 mm。將玻璃管豎立，開口向上，用包埋液填滿玻璃管后以鋁箔封口，最上端脛骨距離管口應(yīng)大于3 cm，4 ℃下凝固4 h。包埋液凝固后，敲碎玻璃管，取出包埋有脛骨的樹脂管，用精密金剛石刀輪機（VC50，LECO 公司）在脛骨近端1/4 處切斷樹脂塊。取余長為3/4的脛骨進行第2次包埋。預(yù)先用刀輪機制備2 mm×10 mm×10 mm的硬質(zhì)樹脂片作為底板，為復(fù)數(shù)脛骨切面提供光滑貼合平面。脛骨切面蘸取包埋液，然后豎立貼合在底板上，每塊底板放置5根脛骨，共制作6個樹脂塊用于后續(xù)實驗。隨后將貼合有脛骨的底板平放于組織包埋瓶中，每瓶加入10 mL包埋液，4 ℃下凝固4 h。
1.6 切片及比較切片前涂抹包埋液對脫片的影響
敲碎組織包埋瓶，將樹脂塊修成合適形狀后，選用Leica TC65 硬質(zhì)標本專用刀片，在全自動旋轉(zhuǎn)切片機（RM2255，Leica）上進行切片。調(diào)節(jié)樹脂塊位置與角度，使得刀片切面與復(fù)數(shù)脛骨切面相平行，切片速度設(shè)置為1.5，切片厚度為4 μm。切片時按照是否涂抹包埋液分成涂抹包埋液組與不涂抹包埋液組。涂抹包埋液組：每次切片前在組織塊切面滴1滴包埋液，用紗布在切面抹勻，大約10 s 包埋液即會干燥，隨后進行切片。不涂抹包埋液組：不涂抹包埋液直接進行切片。兩組分別于同一樹脂塊收集8張切片，使用6個樹脂塊進行重復(fù)實驗，記錄并比較兩組脛骨的脫片情況。對于缺損的脛骨切片，剩余面積大于1/2記為有效的切片，小于1/2記為無效的切片。切片后用展片液（表1）輔助展片，以薄塑料片蓋片后用鉆床虎鉗對切片進行加壓，烘箱中55 ℃干燥2 d。

1.7 鈣黃綠素熒光分析與比較
切片烘干后，置于熒光顯微鏡下觀察鈣黃綠素熒光顯像情況。利用Osteomeasure 軟件分析新骨形成情況。比較涂抹包埋液對骨形成分析的影響。
1.8 探索加熱對切片脫塑水化時脫片的影響及成骨細胞染色觀察分析
樹脂切片染色前需要進行脫塑及水化處理。選用來自上述涂抹包埋液組的切片，在脫塑前，按照是否加熱隨機分成兩組，每組24 張切片，其中加熱組為實驗組，不加熱組為對照組。加熱組：將切片置于干浴孵化器上95 ℃加熱15 min，隨后進行脫塑（AME 15 min→AME 15 min）及水化（100%乙醇5 min→100%乙醇5 min→90%乙醇5 min→80%乙醇5 min→70%乙醇5 min→超純水5 min→超純水5 min）。不加熱組：室溫放置切片15 min。隨后進行脫塑及水化。水化完成后，統(tǒng)計分析兩組脫片情況。隨后對切片進行甲苯胺藍染色。觀察并分析成骨細胞數(shù)量及成骨細胞表面參數(shù)，比較加熱對染色情況的影響。
1.9 分析軟件及統(tǒng)計方法
本實驗中骨生成定量分析及成骨細胞定量分析使用Osteomeasure7.1 軟件。切片觀察使用熒光顯微鏡（BX53F，Olympus），拍攝使用DP73 顯微數(shù)碼相機（Olympus）及CellSens1.9軟件。本實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用IBMSPSS20.0軟件，結(jié)果中數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用Student-t分析檢驗方法進行比較，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 向包埋液沖入CO2可以縮短包埋液的凝固時間
本實驗室用CO2沖入包埋液中（圖1A），以去除氧氣的影響。通過比較沖入CO2及沖入空氣兩組包埋液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在0 h，CO2組的包埋液呈現(xiàn)淺黃色，空氣組的包埋液呈現(xiàn)較深的黃色。在1 h時，CO2組的包埋液呈粘稠液體狀，空氣組的包埋液呈稀釋液體狀。在4 h， CO2組的包埋液已完全凝固成樹脂塊，質(zhì)地堅硬，色澤透明淡黃；空氣組部分瓶中的包埋液呈粘稠液體狀，部分瓶中包埋液呈稀釋液體狀，稀釋液體顏色深于已凝固樹脂（圖1B）。在72 h，空氣組的包埋液完全凝固瓶數(shù)為7瓶，其余3瓶均只有底層包埋液凝固，上層包埋液呈現(xiàn)粘稠液體狀。結(jié)果顯示向包埋液中沖入CO2可以縮短樹脂凝固時間（圖1C），同時可以提高樹脂的凝固成功率（圖1D）。

圖1 向包埋液沖入二氧化碳可以縮短包埋液的凝固時間
Fig.1 Flowing CO2 into the embedding solution reduces polymerization time. A: Schematic diagram of flowing CO2 into theembedding solution; B: Represent pictures showing polymerization of the blocks in CO2 and air groups at 0, 1, 4, and 8 h. The pictures were taken immediately after tilting the vial to observe the viscosity and polymerization of the solution; C: Number of complete polymerized blocks of CO2 and Air groups over time(n=10); D: Rate of complete polymerized blocks of CO2 and Air groups (n=10).

2.2 使用兩次包埋的方式可以將多個脛骨包埋于一個樹脂塊中
第1次包埋時將脛骨包埋成圓柱樹脂塊（圖2A），隨后將所有脛骨在相同的相對位置切斷（距脛骨平臺1/ 4處切斷脛骨，圖2B）。二次包埋時，沾有包埋液的脛骨切面可以與底板貼合緊密，不易傾倒（圖2C、D）。

圖2 使用兩次包埋的方式可將多個脛骨包埋于同一樹脂塊中
Fig.2 Multiple tibias embedded in the same block by 2-step embedding. A: Embedding multiple tibias in a flint glass tube; B: Trimmingthe tibia at the 1/4 proximal part; C: Embedding multiple tibias while maintaining the section plane flat; D: Polymerized block withmultiple tibias.

2.3 使用包埋液涂抹切面可以降低切片時脫片率而不影響鈣黃綠素熒光分析
本實驗發(fā)現(xiàn)，樹脂包埋骨組織切片時，若骨組織切面較小，則容易發(fā)生脫片（如顱骨的矢狀面切片，長骨的橫截面切片），若骨組織相對較大或周圍軟組織較多，則較少發(fā)生脫片（如腰椎的冠狀面切片，股骨的冠狀面切片）。小鼠脛骨的橫截面小，其近中段位置主要為骨髓以及密質(zhì)骨。密質(zhì)骨本身質(zhì)脆堅硬，當對脛骨橫截面進行切片時，脛骨周圍的樹脂難以固定切面脛骨而被一同切下，在切片過程中會出現(xiàn)嚴重的脫片現(xiàn)象（圖3A）。通過計數(shù)發(fā)現(xiàn)，切片時涂抹包埋液組有效切片數(shù)為35.5±2.35，脫片率為（11.25±0.0）%；不涂抹包埋液組的有效切片數(shù)為13±4.65，脫片率為（67.5±0.12），涂抹包埋液可以顯著減少切片時的脫片的發(fā)生（圖3D）。涂抹包埋液后，切片更加完整（圖3B），不會影響對鈣黃綠素熒光的觀察（圖 3C），涂抹組及不涂抹組的 MAR 及BFR/BS 分析差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。涂抹包埋液在切面上，因包埋液干燥后可以形成一層樹脂膜，這相當于在切面上將所有組織覆蓋。當?shù)镀?jīng)過切面時，覆蓋于其上的樹脂膜對切面脛骨起到固定作用，使脛骨與周圍樹脂一同被切下。

圖3 使用包埋液涂抹切面可預(yù)防切片時脛骨脫片
Fig.3 Application of embedding solution on the section surface prevents slide detachment without affecting calcein labeling analysis.
A: Representative scan pictures of Paste and Un-paste slides(scale bar=1 mm); B: Representative unstained paste and non-paste slides under microscope (left panel: scale bar=200 μm; right panel: scale bar=100 μm); C: Representative fluorescent pictures of paste and non-paste slides (left panel: scale bar=100 μm; right panel: scale bar=50 μm); D: Number of effective slides and rate of slides detachment in paste and non-paste groups (***P<0.001, n=6); E: Mineral apposition rate (MAR, μm/d) and bone formation rate (BFR/BS, %/d) in paste and non-paste groups (n.s: P>0.05, n=12).

2.4 脫塑前加熱切片可以降低水化后脫片率并且不影響甲苯胺藍染色結(jié)果
將實驗條件設(shè)置為95 ℃加熱15 min，通過計數(shù)發(fā)現(xiàn)，加熱組在脫塑水化后每張切片剩余有效脛骨切面數(shù)3.17±1.31，脫片率為（28.97±0.29）%。不加熱組在脫塑水化后每張切片剩余有效脛骨切面數(shù)1.92±0.97，脫片率為（56.60±0.22）%。脫塑前加熱切片可顯著性減少脫塑及水化操作造成的脫片（P<0.001，圖4B）。隨后對切片進行了甲苯胺藍染色觀察成骨細胞的情況，結(jié)果顯示，加熱并不會影響對甲苯胺藍染色的染色。加熱組和不加熱組的成骨細胞分析N.Ob/B.Pm和Ob.S/B.S結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05，圖4C）。

圖4 脫塑前加熱切片可降低水化后脫片率而不影響甲苯胺藍染色結(jié)果
Fig.4 Heating before deplastic and hydration prevents slide detachment during staining without affecting Toluidine blue staining.A: Represent Toluidine blue stain of Heated and Un-heated group (A1,A4 scale bar=200 μm,A2,A5 scale bar=100 μm,A3,A6 scale bar=50 μm); B: Number of attached bones per slide of Heated and Un-heated group after hydration(**P<0.01, n=24); C: Number of osteoblast per bone surface and osteoblast surface per bone surface of Heated and Un-heated group (P>0.05, n=12).


鈣黃綠素可以標記骨表面，如果在相同時間間隔進行兩次鈣黃綠素注射，則可以通過分析兩次標記的范圍及距離，比較這段時間間隔內(nèi)新生骨形成的情況，是成骨細胞功能研究中的常用方法［24-25］。由于脫鈣后將無法觀測到鈣黃綠素的標記，因此石蠟包埋法并不適用于觀察新生骨形成的變化。不需要脫鈣的樹脂包埋切片法則能夠發(fā)揮重要作用，并逐漸在國內(nèi)得到推廣。此外，國內(nèi)外也有關(guān)于不脫鈣骨組織的冰凍切片法的報道［23, 26-27］，但因需要頻繁更換刀片，包埋試劑及切片貼紙價格昂貴，標本需要低溫保存等缺點而暫時未能廣泛推廣。樹脂包埋切片耗費的時間較長，如果可以在構(gòu)建標本塊時將多個骨樣本按照相同位置包埋固定，切片時的效率就能明顯提高。本實驗室首次探索了復(fù)數(shù)脛骨平行包埋的方案，包埋時可以確保所有脛骨切面在同一平面上，切片時位置角度調(diào)整方便高效。與傳統(tǒng)的包埋方式相比，此方案不僅明顯縮短了實驗的耗時，還減少了包埋液的使用量，更加節(jié)約開支。
傳統(tǒng)的樹脂包埋方式另一缺點是樹脂塊需要3~6 d時間才能完全凝固［19］，偶爾還會出現(xiàn)無法凝固成硬質(zhì)樹脂塊的情況，若在這種情況下嘗試包埋多個脛骨，難以保證實驗的成功率。既往有文獻提出，氧氣會影響樹脂塊的凝固［22］。我們首次嘗試在制備包埋液的過程中沖入CO2，在不影響各試劑配比的情況下，明顯縮短了樹脂塊的凝固時間，并且提高了樹脂塊的凝固成功率。關(guān)于沖入CO2可以縮短樹脂凝固時間的原因則尚未明確，猜測環(huán)境中O2可能可以影響樹脂分子交聯(lián)，CO2沖入可以移除包埋液環(huán)境中O2，從而對樹脂分子的交聯(lián)產(chǎn)生保護作用，氮氣可能也可以發(fā)揮相似作用，但實驗室中CO2相對容易獲得，因而采用CO2進行實驗。
按照本研究包埋方式，第1次包埋時將脛骨包埋成圓柱樹脂塊，隨后將所有脛骨在相同的相對位置切斷（距脛骨平臺1/4處切斷脛骨）；二次包埋時，沾有包埋液的脛骨切面可以與底板貼合緊密，不易傾倒。這可以確保在切片時，每個脛骨切面的相對位置幾乎一致，不會因為解剖位置差異過大而導致誤差。此前，本實驗室曾嘗試直接切斷脛骨后多個脛骨平行豎立包埋，但由于橫截面小，脛骨難以豎立在底板上，操作耗時長。直接豎立在底板上的脛骨容易傾倒，切片時無法同時切出相對位置一致的切面，對實驗分析造成較大影響。改良后，我們發(fā)現(xiàn)采用兩次包埋的方式可以將多個脛骨包埋于一個樹脂塊中，為隨后的切片提高了效率。13周齡的小鼠脛骨中段橫截面直徑大約為1.5mm，如此小的密質(zhì)骨橫截面在切片過程中難以隨同樹脂一并切下，因而會發(fā)生嚴重的切片脫片現(xiàn)象。因此，我們提出了使用包埋液涂抹的方式輔助切片，并發(fā)現(xiàn)其可以顯著地降低切片過程中的脫片率。這一方法也可用于預(yù)防顱骨矢狀面樹脂切片脫片。因涂抹的包埋液與樹脂成分一致，這種方法并不會影響切片在后續(xù)操作中的展片、脫塑以及鈣黃綠素熒光分析，是一種優(yōu)良的切片輔助方式。此外，不脫鈣骨組織樹脂切片在染色時容易發(fā)生脫片。有相關(guān)文獻報道了不同的防脫片液對預(yù)防脫片的效果［18］，但制作脫片液耗時較長。有研究通過厚度為10~20 μm的軟組織樹脂切片進行實驗，驗證了在115~140 ℃加熱30 min后可以預(yù)防脫片［16］。本實驗室首次嘗試使用加熱的方法預(yù)防不脫鈣骨薄切片脫片，發(fā)現(xiàn)95 ℃加熱15 min可以有效降低脫塑水化后的脫片率，并且不會影響甲苯胺藍染色的觀察以及成骨細胞的分析。小鼠是骨科基礎(chǔ)研究中的重要模型［5, 28］，而盡量保留骨骼成分對骨組織學研究有重要意義。本研究對傳統(tǒng)的樹脂包埋不脫鈣骨組織方法進行了探索與改良，提出同時包埋復(fù)數(shù)小鼠不脫鈣脛骨的方法，提高了獲得及分析新生骨形成及骨礦化數(shù)據(jù)的效率，這一方法可能是一種理想的不脫鈣骨組織研究方法。但在樹脂包埋不脫鈣骨組織實驗中，依然存在一部分待解決的問題，比如切片在的展片過程中容易發(fā)生變形，切片干燥后難以與覆蓋其上的塑料片分離等。本研究將在未來的實驗中對這些問題進行進一步的探索，繼續(xù)優(yōu)化利用樹脂包埋不脫鈣骨組織的方案。

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