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氟是人體必需的微量元素，適量的氟有利于機體鈣和磷的利用，增加骨骼的硬度，但長期超生理劑量攝入可導致氟骨癥。鋁是不是人體必需的元素尚無定論，但它在體內蓄積到一定程度后會產(chǎn)生毒性作用，也會造成軟骨和骨的損害。由于環(huán)境中氟鋁元素多于正常,貴州省部分地區(qū)還有氟鋁中毒導致骨骼嚴重畸形的病例，且易發(fā)骨質疏松癥[1-2]。長期飲用磚茶(氟鋁含量高)，也是內蒙古及東北地區(qū)的人群可能發(fā)生氟鋁聯(lián)合中毒的高危因素[3]。因此氟鋁聯(lián)合中毒的深入研究仍然具有重要的現(xiàn)實意義。

目前關于氟鋁聯(lián)合中毒的實驗研究，多數(shù)集中探討骨骼損害與氟鋁劑量的關系，并且大多是基于體外實驗結果［4-5］，對于短期氟鋁暴露以及停止暴露后藥物干預對骨重建狀態(tài)及長骨生長發(fā)育影響的研究還少見報道。因此，本研究通過骨組織形態(tài)計量學方法觀察氟鋁攝入不同時間以及停止氟鋁暴露后藥物干預對大鼠長骨縱向生長以及骨重建的影響，為地方性氟鋁聯(lián)合中毒的深入研究和防治提供理論依據(jù)。

一、材料與方法

1.1 試劑與儀器

氟化鈉( NaF; CAS: 7681-49-4; 批號: 20130528; 天津市光復精細化工研究所生產(chǎn)) ，氯化鋁( AlCl3; CAS:7446-70-0; 批號: 20121102; 天津市福晨化學試劑廠生產(chǎn)) ，牡蠣碳酸鈣片( 25mg·片－1，批號: 120304; 廣州白云山光華制藥股份有限公司生產(chǎn)) ，羅蓋全( 0.25 μg·粒－1，批號: 20130011; 上海羅氏制藥有限公司生產(chǎn)) 。染色劑甲苯胺藍( CAS: 92-31-9; 批號:

71041284; Sigma Chemical Co．美國生產(chǎn)) ; 包埋單體甲基丙烯酸甲酯( CAS: 1330-20-7; 批號: 20161017; 北京化工廠生產(chǎn)) 。不脫鈣制片所需慢速鋸( Buehler，美國) ，硬組織切片機( Leica ＲM2265，德國) ; 骨形態(tài)計量分析所需熒光顯微鏡( DMLB，Leica，德國) 及顯微照相機( Olympus DP72，日本) ，骨形態(tài)計量學測量系統(tǒng)( OsteoMetrics3． 1， Inc，美國) 。

1.2 分組及給藥

48只2 月齡清潔級SD大鼠，雌雄各半，隨機分成6組: 對照45d和90d組，氟鋁45d組和氟鋁90d組［氟鋁( 30mg·kg－1·d－1 NaF + 0.1 mg·kg－1·d－1AlCl3) 暴露45d組和90d組］，氟鋁中斷組( 氟鋁45d后停止暴露) ，藥物干預組［氟鋁45d 后停止暴露并給予鈣加維生素D( 37.5g·kg－1·d－1 鈣+ 0.052 μg·kg－1·d－1維生素D) 聯(lián)合治療］。年齡對照組用生理鹽水按10 ml·kg-1用量灌胃，所有藥物配置成一定濃度的溶液，每日1次灌胃，分別給藥45d和90d。動物分籠飼養(yǎng)，保持條件: 室溫24～28 ℃，濕度50%～60%。實驗期間根據(jù)每周稱重調整灌胃給藥量。

1.3 骨形態(tài)學標本制備及形態(tài)計量學參數(shù)測量

左側脛骨除凈肌肉和軟組織，矢狀面鋸掉脛骨粗隆部分，暴露骨髓腔，橫斷后取約1cm的脛骨近端固定液中存放，之后經(jīng)逐級脫水、脫脂，甲基丙烯酸甲酯包埋，打磨光滑后再經(jīng)硬組織切片機切成10μm和5μm的切片。厚片熒光顯微鏡下進行骨代謝及小梁微結構的測量分析。薄片甲苯胺藍法染色，光鏡下觀察骺板( 生長板) 軟骨細胞層，初級骨小梁以及初級小梁往下延伸3 mm 區(qū)域內的次級小梁并進行相關計量學分析。其測量范圍及參數(shù)含義參見相關文獻［6］。

主要微結構參數(shù)有骨小梁容積/總容積( bone volume /tissue volume，BV/TV) 、骨小梁厚度( trabecular thickness，Tb.Th) 、骨小梁數(shù)量( trabecular number，Tb.N) 、骨小梁分離度( trabecular separation，Tb.Sp) 及生長板厚度( growth plate width，G. P. Wi) 等，骨小梁容積即骨量。反映骨形成的參數(shù)有骨小梁熒光周長/骨小梁周長( mineralization surface /bone surface，MS /BS) 、骨形成率( bone formation rate /tissue volume，BFＲ/TV) 、成骨細胞周長( osteoblast surface，Ob.S) 、類骨質周長( osteoid surface，O.S) 及骨吸收參數(shù)破骨細胞周長( osteoclast surface，Oc.S) 等。骨建造單位( bone modeling unit，BMU) 和骨重建單位( bone remodeling unit，BＲU) 分別計數(shù)。骨建造單位的判斷標準是: 附著于小梁表面，膠原纖維走向與舊骨一致，黏合線( 與舊骨的分界) 光滑，小梁表面雙熒光標記多見( 無熒光的小梁不計算在內) ，小梁的大小、形狀往往發(fā)生改變。骨重建的特點是: 發(fā)生在吸收陷窩內，新骨形狀像一個袋子，纖維走向與舊骨不同，黏合線粗糙，不夠光滑，可見雙熒光或單熒光，小梁基本維持原狀?？梢烧呒肮切纬伸o止表面( 無熒光) 均不計算在內。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18. 0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以x ± s 表示，不同實驗周期( 45d 和90d) 氟鋁暴露的影響采用雙因素方差分析，相同實驗周期( 90d) 各處理因素的影響采用單因素方差分析，再分別采用LSD-t 檢驗進行組間兩兩比較。P ＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 停止氟鋁暴露及藥物干預對大鼠體重的影響

短期( 45d) 內不管是否攝入氟鋁，大鼠體重都是逐漸增加的。隨后，氟鋁組體重不增甚至下降，實驗結束時，氟鋁90d的體重比對照90d組下降了14.90%( P ＜ 0.05) 。藥物干預組體重則比氟鋁90d組增加18.90% ( P ＜ 0.05) 。氟鋁中斷組體重介于藥物干預組和對照90d組之間。

a 氟鋁90d組與對照90d組比較，P ＜ 0.05; b 藥物干預組與氟鋁90d組比較，P ＜ 0.05

圖1 停止氟鋁暴露及藥物干預后大鼠體重的變化

2.2 停止氟鋁暴露及藥物干預后大鼠脛骨G. P. Wi及細胞形態(tài)的變化

與相應年齡對照組比較，氟鋁45 d組和90 d 組的G.P.Wi 分別增加了27.8%( P＜0.01) 和34． 53%( P＜0.01) 。氟鋁45 d 組軟骨細胞層次清楚，排列整齊，形態(tài)無異常，而氟鋁90 d 組肥大細胞擁擠，潴留。氟鋁中斷組的G． P． Wi 為( 173． 43 ± 12.21) μm，高于對照90 d 組的( 136.62 ± 6.54) μm( P ＜ 0.05) 。藥物干預組的G.P.Wi( 150.35 ± 10.25) μm，低于氟鋁90 d 組的( 183.80 ± 17.59) μm( P ＜ 0.05) ，與對照90 d 組接近，且軟骨細胞層次清楚，形態(tài)未發(fā)現(xiàn)異常。

A.對照45d組; .氟鋁45d組; C.氟鋁中斷組; D.對照90d 組; E.氟鋁90d 組; F.藥物干預組

圖2 停止氟鋁暴露及藥物干預后大鼠脛骨G.P.Wi 及細胞形態(tài)的變化(甲苯胺藍染色× 400)

2.3 停止氟鋁暴露及藥物干預后大鼠脛骨近端骨小梁微結構的改變

2.4 停止氟鋁暴露及藥物干預后大鼠脛骨近端骨小梁骨重建的改變

與對照45d組比較，氟鋁45d組的MS /BS、BFＲ/TV、Ob.S 及O.S 明顯增加。氟鋁90d組的上述指標比氟鋁45d組明顯下降，BFＲ/TV 和Ob.S 甚至要低于對照90d 組。氟鋁中斷組的各項指標與年齡對照90d組和氟鋁90d組相比差異均無統(tǒng)計學意義。藥物干預組的Oc.S 明顯比對照90d 組，氟鋁90d組和氟鋁中斷組增加。見表2。

氟鋁45d組的骨形成增加主要是以骨建造為主，即新骨形成增加( 箭頭所示) ，見圖3A。氟鋁45d組的BMU/BＲU 高于對照45d組( 3.11 ± 0.28 vs 1.44 ±0.42，P ＜ 0.05) ; 氟鋁90 d 組的BMU/BＲU 低于氟鋁45d組( 0.67 ± 0.28 vs 3.11 ± 0.28，P ＜ 0.01) ，與對照90d組差異無統(tǒng)計學意義。氟鋁中斷組BMU/BＲU 仍高于氟鋁90d組( 1.50 ± 0.42 vs 0.67 ± 0.28，P ＜0. 05) 。藥物干預組表現(xiàn)為骨重建比例增加，即舊骨改造增加( 箭頭所示) ，見圖3B。藥物干預組的BMU/BＲU 明顯低于氟鋁中斷組( 0.25 ± 0.08 vs 1. 50 ±0. 42，P ＜ 0.05) ，甚至低于對照90 d 組( 0.25 ± 0.08vs 0.72 ± 0.19，P ＜ 0.05) 。

3 討論

長骨生長板( 即骺板) 中的軟骨細胞持續(xù)的增殖分化過程決定著長骨的生長。體外研究［7］結果表明，氟對軟骨細胞呈現(xiàn)低劑量促進、高劑量相對抑制其功能的雙向作用。動物體內實驗( 短的60d，長至6個月) ［8-9］發(fā)現(xiàn)，氟或氟鋁造成大鼠骺板增厚，軟骨礦化延遲甚至壞死。本實驗發(fā)現(xiàn)，氟鋁在體內短期促進、長期抑制軟骨細胞功能。這是因為氟和鋁都是帶電荷的離子，可引起體內細胞內外Ca2 + 濃度的改變，影響鈣的正常代謝，軟骨基質不能及時礦化為初級小梁骨。同時，氟鋁對軟骨細胞均有直接毒性作用，氟直接損傷細胞線粒體和內質網(wǎng)，鋁競爭性抑制蛋白聚糖與基質膠原結合，形成不成熟的軟骨基質［10-11］，還在體內與Ca2+、Mg2+、Fe2+等陽離子競爭，干擾細胞能量代謝。短期氟鋁暴露時，體內內環(huán)境存在一定的代償，僅表現(xiàn)出對軟骨細胞的刺激作用。然而，隨著暴露時間的延長，氟鋁對軟骨細胞和基質的毒性作用逐漸累積并顯現(xiàn)。氟鋁組的體重變化( 先增后減) 也間接支持了長期氟鋁暴露對長骨生長的抑制作用。鈣和維生素D對生長板細胞并沒有顯著影響，但體重的恢復間接說明了藥物干預對整體的積極效應。本實驗的結果還發(fā)現(xiàn)，氟鋁聯(lián)合短期暴露刺激骨形成，長期則抑制骨形成，骨吸收的改變則不明顯。目前已經(jīng)明確成骨細胞功能活躍是氟骨癥骨病變中一個發(fā)生較早、并起主導作用的環(huán)節(jié)［12］。成骨細胞的激活與細胞內Ｒunt 相關轉錄因子2( Ｒunx2) 、Wnt /β-連環(huán)蛋白、骨形態(tài)發(fā)生蛋白( BMP) 、磷脂酰肌醇3-激酶( PI3K) /Akt、刺猬蛋白( Hedgehog) 、胰島素受體等一系列的信號調控通道均有關［13-14］，繼而改變相關基因或蛋白的表達，對成骨細胞的增殖分化，凋亡，甚至對細胞外基質的分泌、礦化等產(chǎn)生影響。此外，氧化應激和內質網(wǎng)應激，細胞內外鈣矛盾機制也與氟對成骨細胞的激活密切相關［15］。鋁對成骨細胞的功能則是抑制的，主要還是對細胞的直接毒性作用［16］。本實驗中，氟鋁短期內只激活骨形成，不但印證了成骨細胞激活是最先啟動的環(huán)節(jié)，同時也說明，在高氟低鋁的聯(lián)合攝入中，短期內仍是以氟的作用為主，或者氟對骨形成的刺激作用掩蓋了低鋁直接抑制骨形成的作用。相對而言，氟鋁對破骨細胞的作用存在許多爭議。有實驗［17］證明，氟對體外培養(yǎng)的小鼠破骨細胞也有低劑量促進，高劑量抑制的雙向作用。體內實驗［18］則發(fā)現(xiàn)，氟暴露時破骨功能活躍，骨吸收、骨轉換均增加，但多數(shù)是基于血清和生化檢測結果，基本沒有直觀的形態(tài)學資料和數(shù)據(jù)。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，不管氟鋁暴露時間長短，Oc.S 并沒有明顯改變。BMU/BＲU 增加說明氟鋁短期暴露時，促進新骨形成。這種骨建造的特點就是在不同的骨小梁表面發(fā)生，不與骨吸收偶聯(lián)，也解釋了骨吸收為什么沒有隨著骨形成的增加而增加。

藥物干預組的骨吸收明顯增加，BＲU 也增加，說明鈣和維生素D 干預促進舊骨改造。由于氟離子置換羥基磷灰石中的羥基，形成難溶的氟磷灰石在骨中沉積。鋁是三價的金屬離子，在體內與磷酸鹽形成難溶性磷酸鋁鹽，也在骨骼沉積。因此，雖然氟鋁短期暴露時成骨是增加的，但并非完全是正常沉積的羥基磷灰石成分。另外，氟和鋁可通過多種途徑導致整體低

鈣-靶細胞內高鈣的鈣矛盾現(xiàn)象［19］。在這種情況下給予鈣和活性維生素D，細胞內外Ca2 + 濃度差將產(chǎn)生變化，誘發(fā)單核巨噬細胞和破骨細胞內的鈣振蕩，使破骨細胞數(shù)量增多、功能活躍，增加對陳舊骨基質的吸收［20］，因此，藥物干預組的骨重建增加，是以正常的鈣磷灰石替代了氟磷灰石、磷酸鋁鹽等異常的沉積物，對骨小梁的質量將發(fā)揮積極的影響。

綜上所述，氟鋁暴露短期內促進長骨生長和骨建造為主的骨形成，長期則抑制骨生長及骨形成。氟鋁停止暴露后短期促進作用逐漸消失。停止氟鋁暴露后給予鈣和維生素D 聯(lián)合干預治療不增加骨形成，但增加骨吸收，促進舊骨改造，改善骨質量。

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