用于骨修復(fù)的生物材料及器械在進(jìn)行臨床試驗(yàn)前均需要進(jìn)行臨床前安全性和有效性動(dòng)物試驗(yàn)研究，以預(yù)測(cè)其應(yīng)用于臨床可能發(fā)生的不良作用[1，2]。骨修復(fù)材料的動(dòng)物試驗(yàn)研究需要制備合適的骨缺損動(dòng)物模型，將骨修復(fù)材料植入到制備的骨缺損區(qū)域，評(píng)價(jià)骨缺損部位的局部炎癥反應(yīng)、骨整合程度、骨重建情況，對(duì)該骨修復(fù)材料的安全性及有效性進(jìn)行評(píng)價(jià)[3，4]。生物材料及醫(yī)療器械動(dòng)物試驗(yàn)周期結(jié)束后，需要剖檢、取樣，切取連帶植入物及其周邊骨組織進(jìn)行病理組織切片制備，以觀察生物材料及醫(yī)療器械與宿主骨組織結(jié)合界面的結(jié)合情況及其在動(dòng)物體內(nèi)的吸收降解情況。與普通的石蠟包埋組織切片制備方法相比，埋置有植入物的骨組織標(biāo)本進(jìn)行組織切片制備時(shí)采用樹脂包埋病理組織切片制備方法不需要進(jìn)行脫鈣處理，不需要額外剔除組織內(nèi)埋置的植入物，可完整的觀察到植入物與宿主骨組織結(jié)合界面的組織反應(yīng)情況，實(shí)現(xiàn)對(duì)植入物與骨組織結(jié)合界面組織細(xì)胞學(xué)變化的研究。本研究對(duì)植入了骨修復(fù)材料小型豬腰椎椎體不脫鈣病理組織切片制備方法進(jìn)行了研究，以期能為相關(guān)研究人員提供參考。
1.1.1 組織標(biāo)本
按照《醫(yī)療器械動(dòng)物試驗(yàn)研究注冊(cè)審查指導(dǎo)原則第二部分：試驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)施質(zhì)量保證（2021 年第75 號(hào)）》進(jìn)行骨修復(fù)材料產(chǎn)品安全性和有效性評(píng)價(jià)動(dòng)物試驗(yàn)研究方案的設(shè)計(jì)與實(shí)施[5]。試驗(yàn)研究制備小型豬腰椎椎體骨缺損動(dòng)物模型，將委托方提供的骨修復(fù)材料植入到制備的缺損部位，動(dòng)物試驗(yàn)研究周期結(jié)束后獲得了植入了骨修復(fù)材料的腰椎椎體骨組織標(biāo)本。
1.1.2 主要試劑及儀器設(shè)備
主要試劑：
10 %中性福爾馬林溶液（購(gòu)自濟(jì)南百博生物技術(shù)股份有限公司），無水乙醇（購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），蘇木精染液、伊紅染液及甲苯胺藍(lán)染色試劑盒（購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司），Technovit 7200 光聚樹脂（購(gòu)自德國(guó)EXAKT 公司）。
主要儀器設(shè)備：
E300CP 型硬組織切片機(jī)、E400CS 型硬組織磨片機(jī)、E402 型平行粘片裝置、E510 型脫水浸潤(rùn)儀、E520 型光固化包埋機(jī)、E530 型干燥滲透聚合裝置、E312 型骨組織病理切割機(jī)（德國(guó)EXAKT公司）。
骨組織標(biāo)本采用石蠟包埋法進(jìn)行病理切片制作時(shí)，必須先用乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、硝酸、甲酸等脫鈣液對(duì)骨組織標(biāo)本進(jìn)行脫鈣處理[6-8]。在骨組織內(nèi)埋置有植入物的情況下石蠟包埋組織切片并不適用，原因是硬化后的石蠟雖具有一定的硬度，但其硬度不足以支撐去切組織內(nèi)包埋的植入物，切片過程會(huì)造成蠟塊碎裂[9-11]。
樹脂包埋法制備病理組織切片與常規(guī)" 石蠟包埋組織切片" 相比，制片步驟更為復(fù)雜繁瑣，制片周期更長(zhǎng)，組織標(biāo)本需要?dú)v經(jīng)組織切割暴露切面、梯度乙醇脫水、不同體積比的Technovit 7200VLC 樹脂/乙醇混合液浸潤(rùn)、光聚合包埋、制備平行粘片，切片、磨片，才可制備出一張不脫鈣的骨組織病理切片。
上述報(bào)道的骨組織病理切片制備方法所適用的病理染色方法少，這是其缺陷所在，造就了適用范圍受限。同時(shí)，這種方法制備病理切片周期長(zhǎng)，僅組織標(biāo)本的浸潤(rùn)處理過程就需要近40天。其優(yōu)點(diǎn)是骨組織制片過程中不需要脫鈣處理，組織在埋置有植入物的情況下，不需要剔除植入物，這是" 石蠟包埋組織切片" 所實(shí)現(xiàn)不了的，上述報(bào)道的骨組織病理切片制備方法可作為傳統(tǒng)的、經(jīng)典的" 石蠟包埋組織切片技術(shù)方法" 的補(bǔ)充。
利用該技術(shù)方法制備含骨修復(fù)材料腰椎椎體不脫鈣病理組織切片時(shí)，需注意以下細(xì)節(jié)：
（1）若切取的骨組織標(biāo)本體積較大，應(yīng)延長(zhǎng)固定時(shí)間且固定過程中，應(yīng)多次更換新的固定液，骨組織標(biāo)本經(jīng)骨組織病理切割機(jī)分切后，應(yīng)該繼續(xù)固定至少12 h，以使組織標(biāo)本得到充分的固定。
（2）因不脫鈣的骨組織標(biāo)本致密緊實(shí)，應(yīng)在抽真空負(fù)壓的條件下進(jìn)行骨組織標(biāo)本的脫水、浸潤(rùn)處理，以使組織標(biāo)本脫水充分，樹脂包埋液浸潤(rùn)更加完全，更利于后續(xù)的組織切片制備。
（3）進(jìn)行光聚合固化包埋時(shí)，應(yīng)先利用干燥滲透聚合裝置抽真空，排凈包埋模具內(nèi)殘存的氣泡，以免影響組織塊的聚合、固化。
（4）平行粘片制作過程中應(yīng)利用磨片機(jī)充分對(duì)需要觀察的組織切面拋光處理，以免出現(xiàn)組織切片厚薄不一現(xiàn)象。
（5）在磨片時(shí)，磨盤轉(zhuǎn)速應(yīng)設(shè)置的盡可能的低，以免造成植入的骨修復(fù)材料與宿主骨組織脫離，致使長(zhǎng)入骨修復(fù)材料的新生骨組織丟失，影響后期的組織病理學(xué)分析。
與普通的石蠟包埋法病理組織切片制備方法不同，本研究采用Technovit 7200 VLC光聚樹脂進(jìn)行骨組織標(biāo)本光固化包埋，借助EXAKT 硬組織病理切磨系統(tǒng)制備骨組織標(biāo)本的不脫鈣病理組織切片，組織切片制備過程中所用的并不是傳統(tǒng)的病理切片刀，而是鑲嵌有金剛石的無齒切割帶鋸，以" 鋸" 的形式對(duì)組織進(jìn)行切割，制備組織切片。該方法制備的病理切片最顯著的特點(diǎn)是不需要對(duì)骨組織進(jìn)行脫鈣處理，可使骨組織結(jié)構(gòu)形態(tài)保持完好，骨的礦化結(jié)構(gòu)不被破壞，可用于含金屬、陶瓷、骨水泥等骨修復(fù)材料的臨床前安全性和有效性的骨缺損修復(fù)動(dòng)物試驗(yàn)研究[12]。同時(shí)，該技術(shù)方法制片過程中不需要剔除植入到骨組織中的植入物，保持了骨組織與植入物之間原有的組織結(jié)構(gòu)形態(tài)，可直觀反應(yīng)結(jié)合界面的組織生長(zhǎng)結(jié)合情況，這對(duì)骨缺損修復(fù)試驗(yàn)的組織長(zhǎng)入研究具有重要意義，可用于3D 打印多孔洞類材料組織長(zhǎng)入等生物組織相容性研究[13]。
生物材料及醫(yī)療器械動(dòng)物試驗(yàn)研究的目的是預(yù)測(cè)其應(yīng)用于臨床可能發(fā)生的不良反應(yīng)，是醫(yī)療器械臨床前安全性評(píng)價(jià)必須進(jìn)行的一項(xiàng)試驗(yàn)研究[14]。動(dòng)物試驗(yàn)研究組織病理學(xué)評(píng)價(jià)是該評(píng)價(jià)體系中重要的一環(huán)，用以確定產(chǎn)品組織相容性，是評(píng)價(jià)其安全性并判定是否可以應(yīng)用于臨床的重要研究手段[15，16]。樹脂包埋法制備病理組織切片無需進(jìn)行脫鈣處理，在動(dòng)物試驗(yàn)研究中結(jié)合動(dòng)物活體親骨熒光素標(biāo)記技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)測(cè)量骨修復(fù)過程中的新生骨礦化率和礦化速率，進(jìn)行骨形態(tài)計(jì)量學(xué)研究[17，18]。制備的病理組織切片最顯著的特點(diǎn)是不破壞植入到骨組織中的植入物，保持了骨組織與植入物之間原有的組織結(jié)構(gòu)形態(tài)，該技術(shù)方法結(jié)合掃描電鏡技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)觀察成骨細(xì)胞在骨修復(fù)材料表面及孔隙內(nèi)附著及生長(zhǎng)情況，從而判斷骨修復(fù)程度，同時(shí)結(jié)合掃描電鏡技術(shù)可實(shí)現(xiàn)觀察骨修復(fù)材料表面侵蝕及骨質(zhì)沉積情況的研究[19-22]。
20世紀(jì)80年代，為研究骨組織的礦化程度及新骨形成情況，塑料包埋技術(shù)開始應(yīng)用于骨組織病理切片的制備，近年來許多實(shí)驗(yàn)室在塑料包埋方法上進(jìn)行了創(chuàng)新，特別是在包埋聚合液及其聚合條件方面做了多種改進(jìn)[23-26]。有文獻(xiàn)報(bào)道用甲基丙烯酸甲酯（MMA）及鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）為滲透劑，甲基丙烯酸甲酯為包埋劑，包埋聚合制備骨組織塑料包埋切片的技術(shù)方法，但這一制片技術(shù)因操作煩瑣，制作周期長(zhǎng)，且塑料包埋塊制備過程復(fù)雜，組織切片制備過程對(duì)溫度要求高，目前該技術(shù)方法仍然在用，但未得到廣泛應(yīng)用[27，28]。本研究制備不脫鈣骨組織病理切片包埋劑采用的是光聚樹脂，通過黃光與藍(lán)光共同輻照完成組織包埋塊的包埋聚合，與傳統(tǒng)的" 石蠟包埋組織切片" 方法及" 塑料包埋技術(shù)" 組織切片方法制備骨組織病理切片所用的包埋劑不同，組織標(biāo)本的浸潤(rùn)處理及切片方式也不同。
本研究制備的含骨修復(fù)材料腰椎椎體不脫鈣病理組織切片，光學(xué)顯微鏡下可清晰觀察骨缺損部位植入骨修復(fù)材料后組織結(jié)合界面骨的各種組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可進(jìn)行骨缺損修復(fù)后骨組織重建進(jìn)程及炎癥反應(yīng)研究，適用于生物材料及醫(yī)療器械臨床前動(dòng)物試驗(yàn)安全性評(píng)價(jià)的組織病理學(xué)研究。
[1] 盧俊欽,楊鑫,李軍,等.仿生修飾結(jié)合三維打印技術(shù)構(gòu)建的膠原－聚己內(nèi)酯支架可促進(jìn)兔臨界骨缺損修復(fù)[J].組織工程與重建外科,2021, 17(1): 1-7
[2] 倪王成, 胡琳馳, 張維丹, 等. 3D 打印和CAD/CAM 氧化鋯種植體骨結(jié)合性能的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)[J].口腔醫(yī)學(xué), 2021, 41(2): 144-148
[3] 張虎雄,李微,楊物鵬,等. 3D打印淫羊藿苷/ 脫鈣骨基質(zhì)修復(fù)兔股骨髁骨缺損[J].中國(guó)組織工程研究, 2020, 24(34): 5461-5466
[4] 盧嘉蕊, 權(quán)晶晶. 骨缺損動(dòng)物模型的研究進(jìn)展[J]. 口腔醫(yī)學(xué)研究,2021, 37(9): 783-786
[5] 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局.《醫(yī)療器械動(dòng)物試驗(yàn)研究注冊(cè)審查指導(dǎo)原則第二部分: 試驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)施質(zhì)量保證》(2021 年第75 號(hào)). URL:https://www.nmpa.gov.cn/ylqx/ylqxggtg/20210927153130147.html
[6] 翁丹楓,傅曉丹,陳淑惠,等. EDTA脫鈣在骨組織大切片制片中的應(yīng)用效果[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2021, 37(3): 350-352
[7] 沈吟芳,王謙,郭凌川.石蠟包埋中骨髓標(biāo)準(zhǔn)化脫鈣的應(yīng)用[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2021, 37(7): 867-868
[8] 王德望,龔金梅,彭麗紅,等.喉與下咽切除標(biāo)本脫鈣制片的優(yōu)化處理[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2020, 36(8): 993-994
[9] 毛永建,李華.硬組織切磨技術(shù)及操作要點(diǎn)[J].醫(yī)療裝備, 2020, 33(15): 44-46
[10] 朱福余, 袁暾, 張杰, 等. 含植入物不脫鈣骨組織病理切片技術(shù)在骨組織形態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用[J].醫(yī)療裝備, 2020, 33(19): 30-34
[11] 徐倩,劉飛,李靜, 等. EXAKT硬組織切磨技術(shù)在含有植入物組織切片中的應(yīng)用[J].精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)雜志, 2020, 35(3): 197-200
[12] 李志鵬, 劉遠(yuǎn)翔, 黃若萱, 等. 氟化豬骨羥基磷灰石修復(fù)犬植體周骨缺損的顯微CT 與組織形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)[J]. 口腔種植學(xué)研究, 2020,55(11): 908-914
[13] 王慶,翁益平, 劉宏偉, 等. 3D打印不同孔徑鈦合金支架修復(fù)兔股骨缺損：600μm 孔徑更有利于骨整合[J]. 中國(guó)組織工程研究,2021, 25(28): 4441-4446
[14] 田甜.醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)技術(shù)審評(píng)探討[J].中國(guó)醫(yī)療器械信息,2020, 26(15): 11-13
[15] 朱丹丹, 高關(guān)心, 王學(xué)軍, 等. 醫(yī)療器械臨床試驗(yàn)準(zhǔn)入評(píng)估模型構(gòu)建及應(yīng)用[J].中國(guó)衛(wèi)生質(zhì)量管理, 2021, 28(7): 6-9
[16] 趙霞, 黃雅理, 高顯己, 等. 用7 種醫(yī)療用品原料比較家兔肌肉植入試驗(yàn)兩種評(píng)價(jià)方法的檢測(cè)敏感性[J]. 癌變畸變突變, 2021, 33(4): 307-311
[17] 彭松林,王尚, 王振民, 等. 一種簡(jiǎn)便的骨動(dòng)態(tài)參數(shù)計(jì)量方法[J].生物骨科材料與臨床研究, 2021, 18(1): 9-12
[18] 蔣斯, 匙瑩, 李曄, 等. 微孔鈦網(wǎng)應(yīng)用于犬牙槽骨增量術(shù)中的實(shí)驗(yàn)研究[J].現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2020, 34(2): 90-93
[19] 佘榮峰,張一,陳龍,等.絲素蛋白-殼聚糖支架復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)構(gòu)建組織工程化軟骨的生物相容性[J]. 中國(guó)組織工程研究, 2020, 24(1): 27-32
[20] 吳羽翀, 彭旭, 余喜訊. 摻銪聚磷酸鈣骨組織工程支架可促成骨、血管生成及抗無菌性松動(dòng)[J]. 中國(guó)組織工程研究, 2022, 26(28):4674-4681
[21] 譚國(guó)忠,涂欣冉,郭黎洋,等. 3D打印明膠/ 海藻酸鈉/58S 生物玻璃骨缺損修復(fù)支架的生物安全性評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)組織工程研究,2022, 26(4): 545-551
[22] 焦海山, 宋悅寧, 黃健, 等. 改性殼聚糖基導(dǎo)電復(fù)合材料神經(jīng)導(dǎo)管的體內(nèi)降解及組織相容性觀察[J].中國(guó)修復(fù)重建外科雜志, 2021,35(6): 769-775
[23] 胥維勇, 楊群, 范小莉, 等. 塑料包埋聚合方法的改進(jìn)與應(yīng)用價(jià)值[J].診斷病理學(xué)雜志, 2006, 13(6): 467-469
[24] 徐麗娜,于順祿.骨組織不脫鈣大切片制作技術(shù)[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2018, 34(12): 1397-1399
[25] 張雙燕, 謝幼專, 薛文東, 等. 塑料包埋技術(shù)在骨組織研究中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)生物工程學(xué)雜志, 2006, 12(5): 430-432
[26] 王勇平, 李曉琴, 張輝, 等. 塑料包埋結(jié)合四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記制作不脫鈣骨組織切片的實(shí)驗(yàn)研究[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2012, 28(5): 543-545
[27] 吳哲, 馬冬麗, 洪麗華, 等. 不脫鈣的牙齒骨骼塑料包埋制片技術(shù)及方法探討[J].華西口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2006, 24(6): 564-565
[28] 鄧仲豪, 林錦德, 聊哲霆, 等. 小鼠脛骨不脫鈣樹脂包埋法的改良與應(yīng)用[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2019, 39(9): 1038-1044
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